03/03/2023
0Идентификация видов с помощью химического дактилоскопирования может помочь в борьбе с незаконными поставками древесины
Фото предоставлено: Роберт «Чип» Коди/Джол. Эд Эспиноза позирует возле Woodshed, мобильной лаборатории Службы охраны рыбных ресурсов и дикой природы США, предназначенной для перевозки в порты и пограничные переходы для анализа бревен на месте.
ВКРАТЦЕ
Чтобы обеспечить соблюдение законов и договоров, защищающих исчезающие виды деревьев, федеральные агенты, когда они сталкиваются с древесиной, которая, как они подозревают, была получена в результате незаконных лесозаготовок, должны сначала распознать конкретные виды. Лаборатория Службы охраны рыбных ресурсов и дикой природы США потратила десять лет на разработку метода масс-спектрометрии для быстрой идентификации древесины по видам. Теперь ученые начинают его практическое использование.
Несколько лет назад Дэвид Гейл совершил необычное путешествие в Сибирь. «Я объездил множество лесопилок и лесов и вернулся из России и Китая с 20 кг досок на спине», — вспоминает он.
Гель не был обычным туристом. Он был в регионе в рамках секретного расследования некоммерческой группы под названием Агентство экологических исследований (EIA). Он расследовал подозрения, что дуб, завезенный в США из Китая, прибыл из лесов на востоке России, где рубка леса была запрещена. Эти леса — последнее место обитания диких амурских тигров и амурских леопардов.
С доказательствами, которые Гель собрал, и другой информацией из отчета, составленного EIA , федеральные агенты получили ордер на обыск и совершили налет на штаб-квартиру Lumber Liquidators (теперь называемую LL Flooring). Министерство юстиции предъявило компании обвинения в торговле нелегально заготовленной древесиной. Когда в 2015 году компания Lumber Liquidators признала себя виновной, это был первый в США обвинительный приговор в отношении импортера незаконно заготовленной древесины, и компания выплатила 13,2 миллиона долларов в виде штрафов и пени.
Доказательство этого случая требовало тайного расследования и тщательного изучения торговых отчетов. Возможно, было бы проще, если бы федеральные агенты могли идентифицировать партии защищенной древесины в портах ввоза. Примерно в то же время, когда Гель проводил свои тайные наблюдения, химики из Службы охраны рыбных ресурсов и дикой природы США (USFWS) разрабатывали метод идентификации незаконно вывозимой древесины на месте с помощью химического снятия отпечатков пальцев. Эд Эспиноза и его коллеги из USFWS сыграли важную роль в разработке этого метода идентификации древесины и поделились им с лабораториями правоохранительных органов по всему миру. Этот метод называется прямым анализом в масс-спектрометрии в реальном времени или сокращенно DART-MS. Сегодня набор молекул, который он измеряет, можно использовать для быстрой идентификации вида, а иногда даже региона, из которого был получен кусок дерева.
Тем временем правительства во всем мире стали лучше осознавать масштабы международной торговли древесиной, которая , по данным некоммерческой организации Global Financial Integrity, может достигать 150 миллиардов долларов в год . Законы США возлагают на импортеров ответственность за проверку того, что древесина, которую они ввозят в страну, заготовлена на законных основаниях. Международные договоры защищают одни виды от торговли и ограничивают торговлю другими. Однако соблюдение этих законов может быть проблемой из-за огромных масштабов торговли: ежегодно через порты проходят сотни миллионов кубометров бревен и пиломатериалов, которых достаточно, чтобы 100 раз заполнить Великую пирамиду Гизы (пирамида Хеопса в пригороде Каира М.П.)
«Кому-либо, даже при всем желании, очень и очень трудно реально отследить происхождение своей древесины» до места ее происхождения, — говорит Гейл, который продолжает отслеживать происхождение нелегальной древесины для EIA. Древесина часто проходит через несколько стран, прежде чем попасть к конечному потребителю, и трудно идентифицировать охраняемый вид на глаз. DART-MS, говорят Эспиноза и его коллеги, может обеспечить идентификацию видов на границе. Но прежде чем он сможет раскрыть дела о контрабанде пиломатериалов в портах въезда, ученым необходимо будет преодолеть ряд проблем.
БЫСТРЫЙ СБОР, СЛОЖНЫЕ ДАННЫЕ
Когда USFWS подозревает, что произошло преступление против дикой природы, оно отправляет доказательства в Национальную лабораторию судебной экспертизы рыб и диких животных Кларка Р. Бэвина в Ашленде, штат Орегон. Чтобы поддержать уголовное дело, исследователи в лаборатории узнают как можно больше о рассматриваемом образце, включая его вид и происхождение (регион и популяция). Иногда на эти вопросы отвечают ученые из отделов морфологии и генетики лаборатории. Проблемы, которые они не могут решить, приходят к команде химиков. Эспиноза шутит: «Мы получаем остатки — то, чего не хотят все остальные».
Древесина долгое время была одним из таких остатков, и химики USFWS используют различные химические стратегии, чтобы точно определить идентичность и географию образца. Но Эспиноза и его коллеги отдают предпочтение DART-MS.
DART-MS приобрел популярность в криминалистическом сообществе, которое использует его в уголовных расследованиях, например, для выявления незаконных наркотиков. Но химики-аналитики склонны относиться к этому с некоторым подозрением. Информация, которую он дает, не так точна, как данные других методов масс-спектрометрии, потому что он пропускает обычный этап использования хроматографии для разделения аналитов до того, как они попадут в спектрометр. Этот дополнительный шаг увеличивает время анализа, но уменьшает количество ионов, поступающих в масс-спектрометр в любой момент, что упрощает идентификацию каждого из них. Но, по словам Раби Мусаха, судебного эксперта из Университета Олбани, особенности DART-MS делают его очень подходящим для судебно-медицинской экспертизы. Поскольку метод быстрый, сравнительно недорогой и обычно не требует пробоподготовки,
ТОРГОВЛЯ ДРЕВЕСИНОЙ В ЦИФРАХ
$50 млрд– $150 млрд:
Расчетная годовая стоимость незаконной торговли древесиной по состоянию на 2017 г.
4-й:
Рейтинг незаконной торговли дикими животными среди транснациональных преступных предприятий в стоимостном выражении, согласно оценке 2017 г.
3,9 миллиарда:
Кубометров бревен и дров заготовлено в мире в 2020 году
293 миллиона:
Кубометры бревен и пиломатериалов, проданных на международном уровне в 2020 году. Больше древесины переходит из рук в руки в виде целлюлозы, бумаги, фанеры и других переработанных товаров.
Источники: Группа Всемирного банка, Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций.
Масс-спектрометрия получает информацию о молекулах в образце путем их ионизации и последующего измерения отношения их массы к заряду, когда они попадают на детектор. В то время как обычные масс-спектрометры делают это в вакууме, DART-MS ионизирует образцы на открытом воздухе в процессе, известном как ионизация окружающей среды. Синяя бочка, закрытая с одного конца стальным соплом, нагревает гелий примерно до 400 ° C и продувает его через образец, находящийся в открытом воздушном пространстве, в масс-спектрометр. Поток гелия ионизирует молекулы, сдуваемые с образца, и направляет их в масс-спектрометр для анализа.
В судебно-медицинской лаборатории за пределами Вашингтона, округ Колумбия, в Национальном институте стандартов и технологий (NIST) химик Эдвард Сиско, который сотрудничает с Эспинозой, запускает систему DART-MS.
Обычно Сиско занимается изучением нелегальных наркотиков, но он храбро засовывает самый узкий край деревянной прокладки из хозяйственного магазина в щель на приборе в качестве демонстрации. Пока гелий обдувает образец, он часто поглядывает на монитор в реальном времени, чтобы убедиться, что он не нарушил поток газа. Получение спектра занимает всего минуту.
Все большее число лабораторий судебной экспертизы используют DART-MS для идентификации наркотиков с тех пор, как этот метод был опубликован в 2005 году ( Anal. Chem. , DOI: 10.1021/ac050162j).). Но его принятие не было автоматическим или всеобщим. «Людям нужно время, чтобы согласиться», — говорит Сиско, который держит над своим столом табличку с фразой «Но мы всегда поступали так», перечеркнутой красным. Во-первых, идентификация соединений может потребовать некоторой возни. Две молекулы с одинаковой химической формулой, но очень разными структурами и свойствами, такие как кокаин и скополамин против тошноты, могут изначально выглядеть одинаково и требуют дальнейшего анализа, чтобы их отличить. Чем сложнее смесь, тем сложнее становится эта проблема, потому что все, что уходит с поверхности образца, сразу попадает в масс-спектрометр.
Многие химики не решаются анализировать «спектр, содержащий черт знает сколько вещей», — говорит Сиско. Часть его работы в NIST была сосредоточена на упрощении такого анализа.
АНАЛИЗ ВИДОВ С ПОМОЩЬЮ DART-MS
Древесина сложнее большинства материалов, и поэтому ее еще труднее анализировать, чем типичные для Sisco смеси наркотиков и примесей. Чтобы упростить анализ данных DART-MS, Sisco и его коллега из NIST Арун Мурти недавно создали программу ( J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2021, DOI: 10.1021/jasms.1c00097 ). Мурти говорит, что более простой подход привел к тому, что несколько государственных лабораторий стали более регулярно использовать эту технологию для анализа наркотиков. Это также привлекло внимание Эспинозы и привело к сотрудничеству между учеными NIST и USFWS.
«В первую очередь я строгий химик, и я знаю, что все химики говорят об атмосферной ионизации: «Ах, это полная чепуха», — говорит Эспиноза. Но, по его мнению, сложные спектры не бесполезны — они просто незнакомы большинству химиков.
Когда Эспиноза и его коллеги из USFWS начали анализировать древесину с помощью DART-MS примерно в 2012 году, они подошли к этому как к проблеме идентификации наркотиков ( Rapid Commun. Mass Spectrom. 2012, DOI: 10.1002/rcm.6388 ). Сначала они использовали этот метод для изучения строго охраняемого вида, называемого агаровым деревом, которое продается как благовоние по цене около 2 миллионов долларов за килограмм. Первоначально они сканировали спектры агарового дерева на наличие уникальных метаболитов — органических соединений, которые может производить только агаровое дерево, — поскольку их присутствие было бы верным признаком того, что продукт был агаровым деревом. Но не все виды производят уникальные характерные метаболиты. Чтобы идентифицировать больше видов, они с тех пор расширили свой анализ, чтобы рассмотреть более сложные химические отпечатки пальцев с каждого куска дерева.
Вся древесина в основном состоит из лигнинов и целлюлозы, макромолекул, которые придают материалу структуру и прочность. Но они и другие вездесущие метаболиты, такие как сахара и аминокислоты, мало что говорят химикам об идентичности материала. Для этого исследователи используют неструктурные метаболиты, называемые экстрактивными веществами, которые могут включать фенольные соединения, терпеноиды и воски.
Анализ Сиско в NIST составляет список из 22 наиболее распространенных протонированных ионов в образце древесины. Сиско отправляет этот список ионов Эспинозе для сравнения с его базой данных образцов древесины. Может ли Эспиноза сказать, какое дерево было срублено, чтобы стать частью проекта по благоустройству дома? Он сообщает, что некоторые пики сильно напоминают виды семейства Magnoliaceae, такие как тополь. Но невозможно сказать наверняка, потому что программное обеспечение NIST выбирает только самые распространенные ионы, а не сохраняет полный спектр.
«Количество соединений в образце древесины намного, намного больше, чем в наших смесях лекарств», — говорит Мурти. Ученые обычно идентифицируют одну нелегальную молекулу в смеси, сравнивая ее спектр с несколькими характерными пиками в чистом образце. Но анализ «отпечатка пальца» породы дерева включает просмотр всего его спектра DART-MS, который может включать пики, которые еще предстоит сопоставить с конкретными молекулами.
Процесс сопоставления видов, который использует USFWS, начинается, подобно протоколу лаборатории по поиску наркотиков, с поиска в спектре сигнатурных ионов, которые соответствуют одному или нескольким эталонным видам в базе данных. Затем исследователи сравнивают полный молекулярный отпечаток неизвестного образца с видами, которые могут совпадать. Иногда процесс дает четкие виды. Иногда, имея достаточно данных в базе данных, исследователи могут даже различать географически разные популяции одного и того же вида. В других случаях самое близкое, что они могут подобрать, — это род или семейство.
Еще больше усложняет ситуацию то, что исследователи должны заполнить эту базу данных множеством спектров отдельных образцов, чтобы зафиксировать химическое разнообразие внутри вида. Каждый красный дуб генетически отличается, и эта индивидуальность может быть отражена в тонких различиях в уровне каждой маленькой молекулы, которую он производит. По словам Эспинозы, чтобы понять, как различия между отдельными деревьями могут обобщать тенденции внутри вида, исследователям «пришлось погрузиться в биохимию или популяционную генетику».
Химические проблемы — это то, что удерживало Эспинозу в увлечении судебной экспертизой древесины. По его словам, когда он присоединился к судебно-медицинской лаборатории USFWS несколько десятилетий назад, он думал о ней как о «лаборатории для кроликов и деревьев в Орегоне». «Я подумал: «О, это звучит интересно. Я, вероятно, возьму пару статей и вернусь в академию. Он работает там с 1989 года.
ГЛОБАЛЬНЫЙ КОНТЕКСТ
У USFWS есть стратегическое стремление решить сложную проблему идентификации древесины. «Леса исчезают быстрыми темпами, а мониторинг незаконных сделок не осуществляется должным образом, поэтому приходится бороться за создание технологий, позволяющих обнаруживать нелегальную древесину», — говорит Марк Робертс, основатель консалтинговой компании по экологическому праву под названием Eco Policy Advisors, которая фокусируется на международных лесных преступлениях.
Международные правоохранительные организации все чаще замечают, что группы, занимающиеся контрабандой древесины и пиломатериалов, не отличаются от групп, совершающих другие преступления, связанные с торговлей людьми. В отчете Группы Всемирного банка за 2019 год говорится, что финансовые масштабы и глобальные масштабы контрабанды диких животных и незаконного оборота наркотиков почти одинаковы, но риск юридических последствий для виновных в преступлениях против дикой природы намного ниже. В отчете отмечается, что исторически правоохранительные органы вкладывали гораздо меньше средств в пресечение незаконной торговли древесиной, чем в борьбу с контрабандой людей, оружия или наркотиков. Но активисты говорят, что прибыль от контрабанды древесины часто подпитывает другие виды преступной деятельности.
Леса исчезают быстрыми темпами, а мониторинг незаконных операций не ведется, поэтому ведется борьба за создание технологий, позволяющих обнаруживать нелегальную древесину.
Марк Робертс, президент Eco Policy Advisors
Некоторые из наиболее явных преступлений, связанных с контрабандой древесины, касаются ценных пород древесины, охраняемых Конвенцией о международной торговле видами дикой фауны и флоры, находящимися под угрозой исчезновения, или СИТЕС, тем же самым договором, который запрещает торговлю слоновой костью и чешуей панголина. На двух последних конференциях СИТЕС, проводящихся раз в три года, все большее внимание уделялось задержанию и судебному преследованию контрабандистов древесины.
USFWS работал с многочисленными ботаническими садами, ксилариями и государственными лабораториями по всему миру для сбора масс-спектров деревьев известных видов и географического происхождения. Он не одинок в этом усилии; другая инициатива, World Forest ID, также собирает масс-спектры и другие данные судебно-медицинской экспертизы известных деревьев.
Хотя метаболомика на основе DART-MS стала ведущим международным методом идентификации деревьев, доступны и другие методы. Несколько портов въезда в США установили сложные системы обработки изображений, которые делают увеличенные мультиспектральные фотографии, которые впоследствии могут исследовать специалисты по анатомии древесины. Другие лаборатории проводят генетический анализ. Хотя извлечь геном из твердой древесины сложно, исследователи могут извлечь достаточно меньших генетических маркеров, чтобы провести идентификацию вида, а в одном случае даже сопоставить конфискованную древесину с отдельными незаконно вырубленными пнями в национальном лесу США. Анализ стабильных изотопов может помочь определить регион, из которого поступила древесина, что помогает в некоторых случаях контрабанды, и по крайней мере одна лаборатория опубликовала несколько исследований по использованию спектроскопии в ближнем инфракрасном диапазоне для идентификации определенных пород деревьев.
DART-MS, кажется, имеет наибольшую скорость признания среди этих методов. «Поскольку это так дешево и довольно эффективно, у него многообещающие перспективы», — говорит Гейл из EIA.
USFWS является мировым лидером в области идентификации древесины. В отчете целевой группы СИТЕС от февраля 2022 года о борьбе с незаконной торговлей пиломатериалами конкретно упоминается судебно-медицинская лаборатория агентства. В Центре идентификации и проверки древесины Лесной службы США, который делит лабораторию с группой судебно-медицинских экспертов USFWS, используется только этот метод. «Мы все о DART», — шутит химик Лесной службы Эрин МакКлюр-Прайс.
Федеральные ученые из нескольких агентств, которые работают над идентификацией древесины в Орегоне, обучили ученых из Вьетнама, Перу, Габона и других стран использованию DART-MS, но они думают — и данные быстрого распространения DART в лабораториях по тестированию наркотиков, похоже, подтверждают — что более простые аналитические рабочие процессы помогут технологии распространиться еще дальше. Между тем, команда также пытается внедрить эту технологию в большее количество мест в США, сделав свою лабораторию мобильной.
ВЗЯВ ЕГО В ДОРОГУ
Возле совместной лаборатории в Орегоне припаркован трейлер с гусиной шеей, прицепленный к пикапу USFWS. Трейлер, который Эспиноза и его команда назвали «Сарай для дров», был официально введен в эксплуатацию в ноябре, но до сих пор не запущен. Он оборудован как мобильная лаборатория, которая может доставить его операцию DART-MS для идентификации древесины в порты въезда для быстрого досмотра.
Агенты могут отправить на анализ в лаборатории в Орегоне всего лишь щепку, но до тех пор, пока она не будет обработана, всю партию приходится конфисковать и удерживать, что увеличивает затраты на хранение и обработку. В США существуют ограничения на то, как долго правительство может удерживать конфискованные партии. В делах участвовало до 144 контейнеров одновременно, в каждом из которых хранились бревна на сумму около 2 миллионов долларов.
Вот почему криминалистическая лаборатория решила инвестировать в мобильный масс-спектрометр, который можно взять с собой в дорогу. Эспиноза говорит, что скрининг от 200 до 400 образцов в день на месте в порту был бы разумной целью. «Мы можем отправиться в порт, чтобы оценить на грузы древесины и очень быстро сказать: «Отпусти, отпусти, отпусти»», — говорит он, и одновременно определяем контейнеры, которые должны быть остановлены для дополнительной проверки.
Что веет от дерева
Метаболиты, которые появляются в спектре масс-спектрометрии прямого анализа в реальном времени, могут помочь химикам сузить идентичность дерева, из которого произошла древесина. Большинство спектров включают от 500 до 3000 молекулярных ионов. Как показывают эти примеры, некоторые из них более информативны, чем другие.
| МОЛЕКУЛА | ОПИСАНИЕ |
|---|---|
 |
Молекула-предшественник лигнина, обнаруженная в древесине хвойных и цветущих деревьев. Поскольку он присутствует во всех породах дерева, различать их бесполезно. |
 |
Фрагмент лигнина более распространен в древесине цветущих деревьев, чем в хвойных. Эта молекула может помочь различать эти таксономические группы. |
 |
Один из членов семейства ароматических молекул, обнаруженных в агаровом дереве. Несколько фенилэтилхромонов в спектре могут показать, что образец представляет собой агаровое дерево |
Многие масс-спектрометры являются портативными, и химики, занимающиеся идентификацией наркотиков или обнаружением химического оружия, в прошлом подумывали взять DART-MS с собой в дорогу. Химик на пенсии Х. Дюпон Дерст, соавтор оригинальной статьи DART-MS, провел годы в 1990-х годах, модернизируя системы газовой хроматографии / масс-спектрометрии, чтобы установить их на прицепы тракторов, которые могли посещать склады химического оружия, чтобы убедиться, что оружие было нейтрализовано. Но поскольку этапу масс-спектрометрии в DART-MS не предшествует химическое разделение, метод требует спектрометра с более высоким разрешением, что требует более длинного ионного пути, который может быть более чувствительным к смещению при толчке. После того, как DART-MS был изобретен, Дерст пытался заинтересовать вооруженные силы США в оснащении его для путешествий, но так и не получил финансирования.
«Дюпон был так взволнован этим, что даже позвонил мне домой во время обеда на днях вечером, когда услышал, что Эд наконец получил средства на мобильную лабораторию», — вспоминает один из изобретателей DART-MS Роберт «Чип» Коди из компании по производству аналитических приборов Jeol.
Эспиноза рассматривал возможность установки масс-спектрометра в транспортном средстве для отдыха, но счел этот вариант слишком шатким. Чтобы гарантировать более мягкую езду, он переоборудовал его в прицеп, предназначенный для перевозки породистых скаковых лошадей. Он поставлялся с пневматической подвеской, и Эспиноа добавил коврик для гашения вибраций.
Во время интервью C&EN в ноябре Эспиноза выразил некоторую обеспокоенность тем, что, несмотря на модификации для стабильности, масс-спектрометр может быть просто слишком чувствительным, чтобы выдержать поездку по шоссе. Но после тест-драйва в начале января он радостно сообщает по электронной почте: «Только что вернулся с передвижной лабораторией в целости и сохранности!! . . . Конечно, рядом с большими грузовиками он выглядит крошечным, но когда вы за рулем, он кажется огромным».
В чем исследователи до сих пор не уверены, так это в том, повлияют ли различия в окружающей среде на спектры, которые они собирают. Вода в атмосфере, например, играет важную роль в процессе ионизации DART. Сиско говорит: «Если вы пойдете в порт въезда, например, в администрацию порта Нью-Джерси или в Лос-Анджелес или что-то еще, у вас будут совсем другие условия окружающей среды. . . . Что это сделает со спектрами?»
Вполне возможно, что первая крупная миссия Woodshed будет сосредоточена на взаимодействии с общественностью, а не на правоохранительных органах: Эспинозу попросили привезти его в Вашингтон, округ Колумбия, в марте для участия в праздновании 50-летия Закона об исчезающих видах. «Вымирающие виды» для многих в США могут означать американских журавлей, вилорогих антилоп и лосося, а не палисандр, красное дерево или черное дерево. Но если Эспиноза добьется своего, к 100-летию Закона об исчезающих видах все эти виды все еще будут существовать.
